A-T bazni par. C-G bazni par. 1 bazni par = 1bp 1 kilobaza = 1kb = 1000bp 1 megabaza = 1Mb = bp

Транскрипт

1

2 A-T bazni par C-G bazni par 1 bazni par = 1bp 1 kilobaza = 1kb = 1000bp 1 megabaza = 1Mb = bp

3 Dužina nukleinskih kiselina kod nekih organizama i organela Organizam ili organel Dimenzije (µm) Tip nukleinske kiseline Dužina nukleinskih kiselina TMV ssrnk 6.4 kb = 2.2 µm T dsdnk 170 kb = 57.8 µm E. coli dsdnk Mitohondrij (H. sapiens) kb = 1.4 mm dsdnk 16 kb = 5.4 µm Jedro (H. sapiens) dsdnk kb = 2.0 m

4 Osnove topologije DNK Desni (negativni superzavoj) Lijevi (pozitivni superzavoj) Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

5 Osnove topologije DNK Relaksirana molekula DNK Superzavijena molekula DNK Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

6 KONDENZACIJA HROMOSOMA Virusna DNA Bakterijski hromosom Hromosomi eukariota Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

7 Pakiranje virusne DNK/RNK u kapsidu 1) samostalno 2) uz pomoć drugih proteina i utrošak energije Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

8 1) Samostalno pakiranje virusne DNK/RNK u kapsidu: TMV Virus mozaične bolesti duvana (Tobacco Mosaic Virus TMV) Povoljni uslovi - spontano sklapanje Dužina 300 nm, prečnik 18 nm 2130 identičnih podjedinica proteinskog omotača čvrsto zbijeno u obliku uzvojnice oko jednolančane RNA (6 390nukleotida) Svaka proteinska podjedinica stupa u kontakt s tri nukleotida; Intaktni decenijama infektivan. Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

9 2) Bakterijski hromozom - nukleoid 80% DNK + 20% proteini (RNK?) DNK: obično jedna kružna molekula s negativnim superzavojima bazični proteini HU, IHF i H-NS, slični histonima; specifične ponovljene sekvencije (Bacterial Interspersed Mosaic Elements - BIME), oko 100 domena veličine od oko 40 kb. proteini DNK Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

10 3) Hromosomi eukariota-organizacija DNK u hromatinu 1/3 DNK 1/3 histonski proteini 1/3 nehistonski proteini (do 10% RNK) Histon Baz. A.k. Lys Arg Kis. Akis. % Baz/Kis Akis. Mol. masa kd H1 29 % 1 % H2A 11 % 9 % H2B 16 % 6 % H3 10 % 13 % H4 11 % 14 % Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

11 3) Hromosomi eukariota-organizacija DNK u Hromatinu Nukleosom = osnovna strukturna jedinica hromatina DNK (oko 200 pb) vezana uz histone u dva zavoja H3 i H4 čine tetramer na koji su sa svake strane vezani dimeri H2A i H2B na histonski oktamer namotano je 146 bp DNK = srž nukleosoma histon H1 povezuje nukleosome čineći 11 nanometarsko vlakno

12 Segment DNK molekula Nukleozomna nit Hromatinska nit Petlje hromatinske niti vezane za proteine Dalja kondenzacija tokom diobe Metafazni hromozom izduženi DNK molekul x kraći u metafaznom hromozomu

13 HROMATINSKA NIT NUKLEOZOMNA NIT

14 Metafazni hromozom 11 nanometarsko vlakno zavija u 30 nanometarsku uzvojnicu = hromatinsko vlakno tzv. solenoid solenoidna organizacija je prisutna i u interfaznom hromozomu nukleosom dl DNA 11 nm solenoidna vlakna su u velikim petljma vezana na nehistonske proteine oko kojih je organiziran hromosom ("kostur scaffold ) i na proteine jedarnog matriksa 30 nm solenoido vlakno 6 nukleosoma po zavoju 30 nm proteini kostura cikličke modifikacije histona (acetilacija, metilacija, fosforilacija, vezanje ubikvitina ) telomere 700 nm Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

15

16 Raspletena DNK u procesu kondenzacije i spiralizacije u metafaznom hromozomu DNK Kostur hromozoma sadrži 30 različitih nehistonskih proteina (HMG)

17 Kondenzacija eukariotskog hromozoma Obim pakovanja: Odnos dužine molekule DNK i odgovarajuće dužine hromozoma (hromatina) za interfazni homozom oko 100, u mitozi i do 10x veći. Humani hromozomi u mitozi imaju obim pakovanja oko 7 000, u interfazi oko 700. Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

18 HROMATIN = DNK + 2 KLASE PROTEINA HISTONI H1; H2A; H2B; H3; H4 -mali proteini ( aminokiselina) % ARGININ + i LIZIN + -visoko konzervirana A.K. sekvenca -važni za strukturnu organizaciju hromatina -nespecifični inhibitori ekspresije gena NEHISTONI mala količina nekoliko klasa -enzimi replikacije i transkripcije -modifikatori histona -regulatorni proteini specifični aktivatori gena

19 HROMOZOMI EUKARIOTA specifični tretman hromozoma i bojanje Giemsa bojom otkriva kod kondenzovanih hromozoma tzv. G-trake, specifične i reproducibilne molekularna analiza - osjetljivost na endonukleaze, elekroforeza Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

20 Metafazni hromozomi obojani Giemsa bojom Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

21 Humani hromozom 7 obojen Giemsa bojom p krak centromera q krak Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

22 Tip bojenja hromozoma C-banding constitutive heterochromatin G-banding bojenje Gimzom Q-banding quinacrine R-banding reverzno Gimza bojenje T-banding bojenje telomera

23 Podjela hromozoma u odnosu dužine p i q kraka metacentrik submetacentrik akrocentrik

24 KARIOTIPIZACIJA DIREKTNA METODA: KOŠTANA SRŽ HORION FRONDOZUM INDIREKTNA METODA: KRATKOTRAJNA ĆELIJSKA KULTURA (KRV) DUGOTRAJNA ĆELIJSKA KULTURA (ĆELIJE PLODOVE VODE)

25 KRATKOTRAJNA ĆELIJSKA KULTURA ĆELIJSKA KULTURA 1. UZIMANJE KRVI (KRV + HEPARIN) 2. DODAVANJE FITOHEMAGLUTININA I KULTIVIRANJE (72h /37C) 3. PREKIDANJE KULTURE CITOSTATIKOM KOLHICINOM 4. OBRADA KULTURE: -HIPOTONIJA (KCl) -FIKSACIJA (SIRĆETNA KIS.+ METANOL) -NAKAPAVANJE NA HLADNO PREDMETNO STAKLO 5. BOJANJE HROMOZOMA: -RUTINSKO (GIMZA BOJOM) -OPRUGAVANJE HROMOZOMA (G, R, C, Q- PRUGE)

26 Kondenzacija: euhromatin: transkribira se, a kondenziran samo tokom diobe (geni!) heterokromatin (konstitutivni i fakultativni): jako kondenzovan 5-10x kompaktniji, ne transkribira se. Funkcionalne podjedinice: - centromere su asocirane uz kinetohore i osiguravaju pravilnu segregaciju hromozoma, - telomere omogućavaju replikaciju ravnih krajeva hromozoma. - posebne sekvence na mjestima započinjanja replikacije DNK - ishodišta replikacije. Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

27 Dijelovi metafaznog hromozoma sestrinske hromatide centromera kinetohori telomere Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

28 Jedro u interfazi Pozicioniranje svakog hromozoma u posebnom regionu jedra onemogućava preplitanje i uplitanje DNK raznih hromozoma, a ubrzava pakovanje DNK u toku mitoze. membrana lamina mrnk pora proteinski kompleksi Jedarce (nukleolus) područja hromozoma Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

29 Stanična jezgra Organele s hromozomima i kontrolnim faktorima: produkcija RNK i transport kroz jedarne pore u jedarcetu proizvodnja ribozoma Molekularna Genetika 2007/2008 ver. 0.9 Predavanje br. 3

30

31 FISH metoda comperative genomic hibridisation (CGH), bojenje DNK flurescentnim bojama vezanim za jednolančane DNK probe koje se vežu za specifične sekvence na hromozomima.

32 EUHROMATIN - aktivan HROMATIN = DNK + PROTEINI - rastresit u interfazi - rano se replikuje u S fazi - kodirajuće sekvence - nešto bogatiji G-C parovima HETEROHROMATIN - neaktivan - kondenzovan u interfazi - kasno se replikuje u S fazi - nešto bogatiji A-t parovima Konstitutivni: Fakultativni: a) centromerni visoko repetitivne sekvence b) interkalarni srednje repetitivne sekvence inaktivni X hromozom (Barovo telo)

33 OSNOVNI TIPOVI SEKVENCI EUKARIOTA 1. JEDINSTVENE (SINGLE) SEKVENCE ~ 60% dužina bp euhromatin 2. SREDNJE REPETITIVNE SEKVENCE ~ 30% dužina bp kopija 3. VISOKO REPETITIVNE SEKVENCE ~ 10% SATELITNA DNK 5 10 bp više od 10 5 kopija heterohromatin

34 G E N nematrični lanac 5 3 DNK egzon 1 intron egzon matrični lanac promotor RNK kodirajuća sekvenca terminator mesto otpočinjanja transkripcije mesto završetka transkripcije Veličina gena Prosečno Kb HISTON H4 ~ 1Kb, DISTROFIN 2500Kb BROJ EGZONA u korelaciji sa veličinom gena gen za distrofin 79 VELIČINA EGZONA prosečno 170 bp (apob gen 7.6 Kb) VELIČINA INTRONA u korelaciji sa veličinom gena (od Kb)

35 NF1 gen Egzon 26 Egzon 27 Geni u intronima drugih gena (koriste različite lance)

36 6000 Mb 260 Mb 50 Mb

37

38 Telomere (tandemski nizovi) TTAGGG nekoliko Kb

39 JEDRO ( %) 24 MOLEKULA DNK ( 22 AUTOZOMA, X, Y ) bp Mb MITOHONDRIJE ( %) 1 MOLEKUL DNK bp ~10 molekula DNK/mitohondriji ~ 8000 kopija/ ćeliji

40 GENOM ČOVJEKA

41 GENOM ČOVJEKA SA OZNAČENIM REGIONIMA

42

43 Organizacija humanog genoma HUMANI GENOM GENOM JEDRA 3000 Mb oko gena MITOHONDRIJALNI GENOM 16,6 Mb 37 gena kodirajuca DNK (~10%) geni i srodne sekvence (~30%) Jedinstvene ili srednje repetitivne sekvence nekodirajuca DNK (~90%) DNK van gena (~70%) jedinstvene sekvence ili mali broj kopija (~80%) 13 gena za i RNK 22 gena za trnk 2 gena za rrnk geni u jednoj ili par kopija npr.: za hormon rasta, insulin, distrofin familije gena clanovi u tandemskom nizu npr.: za rrnk, trnk snrnk, histone pseudogeni fragmenti gena introni, sekvence koje se ne prevode itd. srednje do visoko repetitivne sekvence (~20%) tandemska ili netandemska ponavljanja rasuti ponovci clanovi rasuti u genomu npr.: geni za globinske lance, imunoglobuline, kolagen

44 GENOM ČOVEKA JEDARNI MITOHONDRIJALNI Veličina Broj različitih DNK molekula Broj DNK molekula po ćeliji DNK - proteini broj gena repetitivna DNK transkripcija introni 3000 Mb 16.6 Kb 22 autozoma, X i Y 1 prstenasti 23 haploid, 46 diploid više hiljada histoni i nehistonski prot. bez proteina ~ veliki deo veoma malo većinom pojedinačnih gena više gena zajedno prisutni u većini gena odsutni % kodirajuće DNK 3% ~ 93% šifra nasledjivanje univerzalna ima odstupanja Mendelsko, paternalno Y maternalno

45

46 KRATAK KRAK HROMOZOMA Mb ~ 70 GENA KRATAK KRAK HROMOZOMA X GEN ZA DISTROFIN

47 GENI ZA HISTONE familija gena spacer H4 H2B H3 H2A H1 Jedinica transkripcije Tandemski niz više kopija

48 FAMILIJA GENA ZA HISTONE dijelom grupisani na istom hromozomu i na različitim hromozomima

49 Tandemski niz gena za rrnk Jedinica transkripcije 45S 45S 45S 18S 5.8S 28S kopija po hromozomu

50 Smer transkripcije Jedan gen rrnk DNK

51 Primeri grupisanih familija gena ζ 2 Ψ ζ1 Ψ α2 Ψ α1 α 2 α 1 θ grupa gena za α globine na hromozomu 16p ε Gγ Aγ ψβ δ β grupa gena za β globine na hromozomu 11p

52 bakterije gljive biljke insekti mekušci rskavičave ribe koštane ribe vodozemci gmizavci ptice sisari čovek PRIMJERI ORGANIZAM KVASAC VINSKA MUŠICA ČOVJEK KUKURUZ DAŽDEVNJAK VELIČINA GENOMA U Mb bp BROJ HROMOZOMA