SVEUČILIŠTE U ZAGREBU PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET DIPLOMSKI RAD 967/USH

Транскрипт

1 SVEUČILIŠTE U ZAGREBU PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET DIPLOMSKI RAD Zgreb, rujn Din Nejšmić 967/USH

2 UTJECAJ KRIOMLJEVENJA I ULTRAZVUKA VISOKOG INTENZITETA NA PREHRAMBENA VLAKNA POSIJA PROSA I BUČINE POGAČE

3 Rd je izrđen u Lbortoriju z kontrolu kvlitete u prehrmbenoj industriji n Zvodu z poznvnje i kontrolu sirovin i prehrmbenih proizvod Prehrmbeno-biotehnološkog fkultet Sveučilišt u Zgrebu pod mentorstvom doc. dr. sc. Mrine Krpn te uz pomoć Sše Drkul, mg. ing.

4 Diplomski rd izrđen je u okviru znnstveno-istrživčkog projekt Od nusproizvod u prerdi žitric i uljric do funkcionlne hrne primjenom inovtivnih proces (IP ), finncirnog od strne Hrvtske zklde z znnost.

5 Zhvljujem se svojoj mentorici, doc. dr. sc. Mrini Krpn n brojnim svjetim i prenesenom znnju tijekom izrde rd li i tijekom cjelokupnog studij. Veliko hvl Sši Drkul, mg. ing. n pomoći, susretljivosti te uloženom trudu i vremenu pri izrdi ovog rd. Posebno hvl mojim roditeljim, n svemu što su mi omogućili, pružili i što su me uvijek podržvli. Hvl mojoj obitelji, prijteljim i dečku n podršci, rzumijevnju i strpljenju.

6 TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Diplomski rd Sveučilište u Zgrebu Prehrmbeno-biotehnološki fkultet Zvod z poznvnje i kontrolu sirovin i prehrmbenih proizvod Lbortorij z kontrolu kvlitete u prehrmbenoj industriji Znnstveno područje: Biotehničke znnosti Znnstveno polje: Prehrmben tehnologij UTJECAJ KRIOMLJEVENJA I ULTRAZVUKA VISOKOG INTENZITETA NA PREHRAMBENA VLAKNA POSIJA PROSA I BUČINE POGAČE Din Nejšmić, 967/USH Sžetk: U ovom rdu ispitn je utjecj uvjet mljevenj n udjel netopljivih (IDF), vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu (SDFP) i vlkn topljivih u vodi i 78 % etnolu (SDFS) u posijm pros i bučinoj pogči te utjecj ultrzvuk visokog intenzitet (UVI) n udjel vlkn u posijm pros. Mljevenje je provedeno s i bez primjene hlđenj i intermedijrnog hlđenj tekućim dušikom u trjnju od 2, 4, 8 i 12 minut, tretmn UVI s mplitudm 60 %, 80 % i 100 %, u trjnju 5, 12,5 i 20 minut. Rezultti pokzuju kko kriomljevenje i tretmn UVI imju sttistički znčjn utjecj n udjel SDFS u posijm pros, dok kriomljevenje nem sttistički znčjn utjecj n vlkn bučine pogče. Njveći udjel SDFS u posijm pros (1,01 ± 0,00 %) tretirnim mljevenjem određen je u uzorku mljevenom uz primjenu hlđenj tijekom 8 minut, tretirnim UVI primjenom mplitude 100 % tijekom 20 minut (0,75 ± 0,00 %). Ključne riječi: bučin pogč, kriomljevenje, prehrmben vlkn, proso, ultrzvuk Rd sdrži: 50 strnic, 13 slik, 8 tblic, 56 literturn nvod Jezik izvornik: hrvtski Rd je u tisknom i elektroničkom (pdf formt) obliku pohrnjen u: Knjižnic Prehrmbenobiotehnološkog fkultet, Kčićev 23, Zgreb Mentor: doc. dr. sc. Mrin Krpn Pomoć pri izrdi: Sš Drkul, mg. ing. Stručno povjerenstvo z ocjenu i obrnu: 1. Prof. dr. sc. Mirjn Hruškr 2. Doc. dr. sc. Mrin Krpn 3. Doc. dr. sc. Nikolin Čukelj 4. Prof. dr. sc. Ines Pnjkot Krbvčić (zmjen) Dtum obrne: 24. rujn 2018.

7 BASIC DOCUMENTATION CARD Grdute Thesis University of Zgreb Fculty of Food Technology nd Biotechnology Deprtment of Food Qulity Control Lbortory for Food Qulity Control Scientific re: Biotechnicl Sciences Scientific field: Food Technology INFLUENCE OF CRYOGENIC GRINDING AND HIGH INTENSITY ULTRASOUND TREATMENT ON DIETARY FIBER OF MILLET BRAN AND PUMPKIN SEED CAKE Din Nejšmić, 967/USH Abstrct: This study investigted the effect of grinding on insoluble (IDF), dietry fiber soluble in wter but precipitted with 78 % ethnol (SDFP) nd dietry fiber soluble in wter nd 78 % ethnol (SDFS) of millet brn nd pumpkin seed cke. The effect of high intensity ultrsound tretment (HIU) on fiber content of millet brn ws lso investigted. Grinding ws preformed with nd without cooling nd intermedite cooling with liquid nitrogen, during 2, 4, 8, nd 12 minutes. HIU tretment ws performed with mplitude of 60 %, 80 %, nd 100 %, during 5, 12,5 nd 20 minutes. The results showed sttisticlly significnt effect of cryogenic grinding nd HIU tretment on the SDFS content in millet brn, while cryogenic grinding hd no sttisticlly significnt effect on the fiber content in pumpkin seed cke. The highest SDFS content in millet brn treted with grinding ws determined in smple grinded with ppliction of cooling for 8 minutes (1,01 ± 0,00 %) nd in millet brn treted with HIU under conditions of 100 % mplitude nd 20 minutes (0,75 ± 0,00 %). Keywords: cryogenic grinding, dietry fiber, millet, pumpkin seed cke, ultrsound Thesis contins: 50 pges, 13 figures, 8 tbles, 56 references Originl in: Crotin Grdute Thesis in printed nd electronic (pdf formt) version is deposited in: Librry of the Fculty of Food Technology nd Biotechnology, Kčićev 23, Zgreb Mentor: Mrin Krpn, PhD, Assistnt professor Technicl support nd ssistnce: Sš Drkul, MSc Reviewers: 1. PhD. Mirjn Hruškr, Full professor 2. PhD. Mrin Krpn, Assistnt professor 3. PhD. Nikolin Čukelj, Assistnt professor 4. PhD. Ines Pnjkot Krbvčić, Full professor (substitute) Thesis defended: September 24, 2018.

8 Sdržj 1. UVOD TEORIJSKI DIO KRIOMLJEVENJE ULTRAZVUK VISOKOG INTENZITETA Zvuk i podjel prem frekvenciji Ultrzvuk Ultrzvuk niskog intenzitet Ultrzvuk visokog intenzitet PREHRAMBENA VLAKNA Podjel i svojstv prehrmbenih vlkn Netopljiv prehrmben vlkn Topljiv prehrmben vlkn Izvori prehrmbenih vlkn Utjecj prehrmbenih vlkn n zdrvlje PROSO Kemijski sstv pros BUČINA POGAČA Buč Bučin pogč Sstv bučine pogče EKSPERIMENTALNI DIO UZORCI METODA ODREĐIVANJA VLAKANA Princip AOAC metode Kemiklije Uređji i ostl oprem Priprem lončić z filtrciju Priprem uzork Određivnje netopljivih vlkn (IDF)... 21

9 Određivnje vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu (SDFP) Određivnje vlkn topljivih u vodi i 78 % etnolu (SDFS) Deionizcij uzork Postupk određivnj SDFS Priprem slijepe probe METODA ODREĐIVANJA PROTEINA Kemiklije Uređji i ostl oprem Princip određivnj Postupk određivnj METODA ODREĐIVANJA PEPELA Uređji i ostl oprem Postupk određivnj METODA ODREĐIVANJA VODE/SUHE TVARI Uređji i oprem Postupk određivnj OBRADA REZULTATA REZULTATI I RASPRAVA UTJECAJ KRIOMLJEVENJA NA UDJEL VLAKANA U UZORCIMA POSIJA PROSA UTJECAJ KRIOMLJEVENJA NA UDJEL VLAKANA U UZORCIMA BUČINE POGAČE UTJECAJ ULTRAZVUKA VISOKOG INTENZITETA NA UDJEL VLAKANA U POSIJAMA PROSA ZAKLJUČCI LITERATURA... 45

10 1. UVOD U novije vrijeme istrživnj n području prehrmbene tehnologije su sve više usmjeren n rzvoj novih tehnik procesirnj hrne kojim će biti moguće osigurti bolju kvlitetu prehrmbenih proizvod. Tko su kriomljevenje i ultrzvuk visokog intenzitet (UVI) jedne od istrživnih tehnik. Poznto je kko je mljevenje jedn od njstrijih tehnik procesirnj hrne čiji je cilj smnjenje veličine čestic mterijl koji se melje. Tijekom trdicionlnog mljevenj dolzi do povišenj temperture uslijed trenj što može izzvti nepoželjne promjene n mterijlu i gubitk nutritivno vrijednih komponenti. Stog mljevenje pri vrlo niskim temperturm sprječv porst temperture i povećv krhkost mterijl kko bi se postigl mnj veličin čestic. Tretmn ultrzvukom visokog intenzitet izziv fizičke i kemijske promjene n tretirnom mterijlu što dovodi do inktivcije mikroorgnizm i enzim, olkšnog emulgirnj, bolje homogenizcije, ekstrkcije i drugih posljedic (Režek Jmbrk i sur., 2014; Kur i Srivstr, 2018). U zdnjih desetk godin, znimnje potrošč z funkcionlnu hrnu, koj pored osnovnih nutrijent potrebnih z rst i rzvoj orgnizm, sdrži i komponente koje pozitivno utječu n zdrvlje ili smnjuju rizik od nstnk bolesti, sve više rste. Zbog svog znnstveno dokznog pozitivnog utjecj n zdrvlje čovjek, prehrmben vlkn su vrlo vžn bioktivn komponent funkcionlne hrne. Posljednjih godin postoji trend pronlženj novih izvor prehrmbenih vlkn koji se mogu koristiti u prehrmbenoj industriji. Iz tog rzlog cilj mnogih istrživnj postje mogućnost uporbe nusproizvod nmirnic biljnog porijekl, koji zostju nkon njihove primrne prerde, ko lterntivne, jeftine i vžne sirovine z dobivnje prehrmbenih vlkn. Svijest o njihovim pozitivnim učincim n zdrvlje dovel je do rzvoj velikog i potencijlnog tržišt z proizvode i sirovine bogte vlknim. Cilj prehrmbene industrije je povećti udjel vlkn u hrni poput kolč, kreker i ostlih proizvod n bzi žitric, ko i npitk, zčin, sir, umk i drugih (Krlik i sur., 2010; Gćin, 2014; Chu i Hung, 2003). Sirovine poput neoljuštenog zrn pros i bučinih sjemenki predstvljju dobr izvor prehrmbenih vlkn, nisu u širokoj primjeni z ljudsku prehrnu, imju veliki potencijl to postti. Proso je jedinstven u svom kemijskom sstvu jer sdrži više prehrmbenih vlkn, li i drugih bioktivnih komponenti u odnosu n druge žitrice. Udjel vlkn u neoljuštenom zrnu pros ovisi o vrsti pros, iznosi u prosjeku 9,6 %, od čeg 36 % čine 1

11 topljiv vlkn (Issoufou i sur., 2013; Klinov, 2007; Trek-Tilistyk i sur., 2017). Neoljuštene bučine sjemenke sdrže oko 16 % vlkn te su bogte fitosterolim, ntioksidnsim, omeg-3 msnim kiselinm i minerlnim tvrim poput mgnezij i cink (Alfwz, 2004; Mercol, 2013). Bučin pogč se dobiv ko nusproizvod pri proizvodnji bučinog ulj prešnjem bučinih sjemenki, sdrži oko 4,5 % vlkn, bogt je i drugim prethodno nvedenim spojevim koji imju pozitivn utjecj n zdrvlje (Trek-Tilistyk i sur., 2017; Pirmn i sur., 2007). Mnog istrživnj ukzuju kko topljiv vlkn imju znčjniji pozitivn utjecj n zdrvlje od netopljivih (Lttimer i Hub, 2010), stog je jedn od ciljev ovog rd ispitti utjecj kriomljevenj i ultrzvuk visokog intenzitet n povećnje udjel topljivih vlkn. U ovom diplomskom rdu istržit će se utjecj kriomljevenj n udjel netopljivih vlkn (IDF), vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu (SDFP) i vlkn topljivih u vodi i 78 % etnolu (SDFS) u uzorcim posij pros i bučine pogče. Tkođer, istržit će se i utjecj tretmn ultrzvukom visokog intenzitet n udjel nvedenih skupin vlkn u uzorcim posij pros. Z određivnje udjel vlkn koristit će se AOAC metod

12 2. TEORIJSKI DIO 2.1. KRIOMLJEVENJE Mljevenje je jedn od njstrijih tehnik procesirnj hrne čiji je cilj smnjenje veličine čestic mterijl koji se melje (Kur i Srivstr, 2018). Kriomljevenje je mljevenje uz hlđenje kriogenicim poput tekućeg dušik ili ugljikovog (IV) dioksid (CO 2 ) pri vrlo niskoj temperturi od -196 C i pri tmosferskom tlku. Ono se koristi z mljevenje prehrmbenih proizvod ko što su kv, zčini, bilje, kko, sjemenke i oršsti plodovi te hrn podložn promjeni okus i gubitku rome tijekom trdicionlnog mljevenj (Linde, 2018; Anonymous 1, 2018). Tijekom trdicionlnog mljevenj dolzi do povišenj temperture uslijed trenj što može izzvti nepoželjne promjene n mterijlu ili gubitk nutritivno vrijednih komponenti. Stog mljevenje uz hlđenje kriogenicim sprječv porst temperture i povećv krhkost mterijl kko bi se postigle čestice mnje veličine (Kur i Srivstr, 2018). Uporb tekućeg dušik ili CO 2 ko sredstv z hlđenje povećv učinkovitost mljevenj. Proces kriomljevenj uvelike povećv produktivnost i donosi uštedu energije zhvljujući većoj krhkosti proizvod i velikoj brzini mljevenj. Inertn tmosfer sprječv oksidciju proizvod te umnjuje opsnost od eksplozije čime se povećv sigurnost proces. Prilikom mljevenj smnjeno je trošenje mlin, ko i lijepljenje proizvod n stjenke opreme. Zhvljujući niskim temperturm ne dolzi do rspd termolbilnih komponenti proizvod ko kod trdicionlnog mljevenj (Linde, 2018; Anonymous 1, 2018). U prilog smnjenom gubitku biološki ktivnih komponenti govori i rd Kur i Srivstr (2018) u kojem je primijećen već ntioksidtivn ktivnost kore mng tretirne kriomljevenjem u usporedbi s trdicionlnim mljevenjem (Kur i Srivstr, 2018). Singh i Goswmi (2000) nvode kko gubitk hlpivih ulj zčin može biti znčjno smnjen primjenom kriomljevenj. Nisk tempertur kriogenik ohldi zčine i psorbir toplinu tijekom mljevenj, isprvnje kriogenik stvr inertnu i suhu tmosferu koj dodtno doprinosi očuvnju njihove kvlitete (Singh i Goswmi, 2000). Gouvei i sur. (2002) u svom rdu zključuju kko je kriomljevenje vrlo uspješn proces brzog usitnjvnj čestic. Niže temperture mljevenj dovode do mnjih veličin čestic p je time postignut i bolji stupnj homogenizcije. Iko postoji opsnost od kontmincije kriogenicim, postignut veličin čestic i stupnj homogenizcije predstvljju znčjne prednosti (Gouvei i sur., 2002). 3

13 2.2. ULTRAZVUK VISOKOG INTENZITETA Zvuk i podjel prem frekvenciji Zvuk je vl koji se širi prostorom ispunjenim medijem pogodnim z širenje zvučnih vlov. Prem frekvenciji titrnj zvučnog vl, zvuk možemo podijeliti n infrzvuk, zvuk i ultrzvuk. Frekvencij infrzvuk je mnj od 16 Hz, zvuk od 16 Hz do 20 khz, ultrzvuk već od 20 khz. Kko ljudsko uho može čuti zvukove frekvencij u rsponu od 16 Hz do 16 khz, frekvencij ultrzvuk je viš od prg njegove osjetljivosti (Brnčić i sur., 2009; Herceg, 2009) Ultrzvuk Ultrzvuk se može podijeliti n ultrzvuk niskog intenzitet i ultrzvuk visokog intenzitet (Herceg, 2009) Ultrzvuk niskog intenzitet Ultrzvuk niskog intenzitet obuhvć ultrzvučne vlove visoke frekvencije, nziv se i dijgnostički ultrzvuk. Vlovi frekvencij od 1 do 10 MHz, intenzitet mnjeg od 1 W cm -2 ne izzivju fizikln i kemijsk oštećenj mterijl kroz koji prolze te se zto ultrzvuk niskog intenzitet smtr neinvzivnom tehnikom. U prehrmbenoj industriji može se koristiti u nlitičke svrhe z određivnje sstv, strukture ili viskoznosti hrne, ko i z stimulciju ktivnosti živih stnic, površinsko čišćenje hrne, ekstrkciju, kristlizciju, emulgirnje, filtrciju, procese sušenj i zmrzvnj te omekšvnje mes. Pogodn je z procjenu kvlitete prehrmbenih proizvod i prćenje njihovih krkteristik tijekom proizvodnog proces (Herceg, 2009; Herceg i sur., 2009; Drmić i Režek Jmbrk, 2010) Ultrzvuk visokog intenzitet Ultrzvukom visokog intenzitet smtrju se zvučni vlovi niskih frekvencij od 20 do 100 khz, intenzitet od 10 do 1000 W cm -2. Uprvo zbog velike snge ultrzvuk visokog intenzitet uzrokuje fizičke promjene mterijl te određene kemijske rekcije u mterijlim n kojim je primijenjen. Prolzk ultrzvučnih vlov visokog intenzitet kroz mterijl 4

14 uzrokuje ubrzvnje proces difuzije i poboljšv dispergirnje gregt. Tkođer, uništv enzime i mikroorgnizme (Režek Jmbrk i sur., 2014). Ultrzvuk visokog intenzitet se u prehrmbenoj industriji njčešće stvr n nčin d se električn energij pretvr u energiju zvuk pomoću ultrzvučnih pretvrč. Tijekom prolsk vl medijem stvr se izmjenični pritisk i ekspnzijski vrtlozi koji uzrokuju negtivn tlk. Kd je tlk dovoljno nizk d svld intrmolekulrne sile dolzi do formirnj mjehurić kvitcije. Zbog velike snge ultrzvuk veličin mjehurić jko oscilir te se tijekom svkog ciklus ekspnzije i kompresije povećv. Kd mjehurić postigne kritičnu veličinu mjehurić se urušv sm u sebe implodir, stvrjući mikropodručj s visokom temperturom i visokim tlkom što dovodi do mijenjnj fiziklnih i kemijskih svojstv loklnih molekul (Herceg, 2009; Herceg i sur., 2009; Drmić i Režek Jmbrk, 2010). Primjenjuje se z odzrčivnje tekuće hrne, inducirnje rekcij oksidcije/redukcije, ekstrkciju enzim i protein, inktivciju enzim i indukciju nuklecije kod kristlizcije (Režek Jmbrk i sur., 2014) PREHRAMBENA VLAKNA U jednoj od prvih definicij prehrmbenih vlkn, vlkn se krkterizirju ko komponente koje čine stničnu stjenku biljk. Od td je definicij vlkn doživjel nekoliko izmjen. Stručnjci iz rznih područj znnosti vlkn opisuju ko dijelove biljnih orgn, skupinu kemijskih spojev ili ko tvri s pozitivnim učinkom n ljudsko zdrvlje. Prehrmben vlkn tek su ksnije definirn ko sveprisutn komponent hrne biljnog podrijetl koj uključuje mterijle rzličite kemijske i morfološke strukture, otporne n djelovnje ljudskih enzim (Dhingr i sur., 2012). Prem Prvilniku o nvođenju hrnjivih vrijednosti hrne vlkn čine polimeri ugljikohidrt s tri ili više monomernih jedinic koji nisu probvljivi niti se psorbirju u tnkom crijevu, pripdju jednoj od sljedećih ktegorij: jestivi polimeri ugljikohidrt prirodno prisutni u hrni jestivi polimeri ugljikohidrt dobiveni fiziklnim, enzimskim ili kemijskim postupkom iz sirovine i koji imju znnstveno dokzn pozitivn fiziološki učink n orgnizm jestivi sintetski polimeri ugljikohidrt koji imju znnstveno dokzn pozitivn fiziološki učink n orgnizm (NN 29/2009). 5

15 Prehrmben vlkn mogu se opisti ko ugljikohidrtn komponent hrne koj se ne probvlj, nije hidrolizirn endogenim enzimim u tnkom crijevu, već prolzi u debelo crijevo gdje djelomično ili u potpunosti fermentir (Megzyme, 2013). Njčešći spojevi koje podrzumijevmo pod zjedničkim imenom prehrmben vlkn su hemiceluloz, celuloz, lignin, oligoshridi, pektin, gume i voskovi (Dhingr i sur., 2012) Podjel i svojstv prehrmbenih vlkn Postoji nekoliko rzličitih klsifikcijskih sustv z podjelu vlkn: n temelju njihove uloge u biljci, vrste polishrid, topljivosti u probvnom sustvu, mjest probve, produkt rzgrdnje i fiziološke klsifikcije. Međutim, ni jedn od ovih podjel nije u potpunosti prihvtljiv jer je grnice vrlo teško jednoznčno definirti. Njčešće prihvćen podjel vlkn je on prem njihovoj topljivosti u vodi, prikzn u Tblici 1 (Dhingr i sur., 2012). Tblic 1. Podjel prehrmbenih vlkn prem topljivosti, komponentm i glvnim prehrmbenim izvorim (Dhingr i sur., 2012) Krkteristike Komponente vlkn Glvni prehrmbeni izvori celuloz povrće netopljiv prehrmben hemiceluloz žitrice vlkn, mnje fermentbiln lignin drvenste biljke voće, povrće, mhunrke, pektin šećern rep, krumpir topljiv prehrmben mhunrke, ekstrkti morskih vlkn, lko fermentbiln gume trv, mikrobne gume sluzi kcij, biljke rod Sterculi Topljivost vlkn povezn je s strukturom smih vlkn n nčin d ukoliko im je struktur prviln, biti će netopljiv te ukoliko im je struktur neprviln, biti će topljiv. Tkođer, prisustvo funkcionlnih skupin poput krboksilne ili sumporne povećti će njihovu topljivost (Elleuch i sur., 2011). 6

16 Osim prem topljivosti, prehrmben vlkn, moguće je podijeliti prem molekulskoj msi n vlkn velike i mle molekulske mse. U Tblici 2 prikzn je podjel prehrmbenih vlkn prem molekulskoj msi u usporedbi s podjelom prem topljivosti (Megzyme, 2013). Tblic 2. Podjel prehrmbenih vlkn prem molekulskoj msi i topljivosti (Megzyme, 2013) Krtic Definicij Primjeri HMWDF (HMWDF = IDF + SDFP) prehrmben vlkn velike molekulske mse celuloz, neprobvljiv škrob, β-glukni u žitricm, određeni ksilni IDF netopljiv prehrmben vlkn celuloz, neprobvljiv škrob, određeni ksilni SDFP prehrmben vlkn topljiv u vodi, netopljiv u 78 % etnolu β-glukni u žitricm, gur gum SDFS = LMWDF prehrmben vlkn topljiv u vodi i 78 % etnolu (SDFS), prehrmben vlkn mle molekulske mse (LMWDF) fruktooligoshridi, glktooligoshridi, polidekstroz, inulin i neprobvljivi mltodekstrini Promjene kojim prehrmben vlkn podliježu tijekom prolsk kroz probvni sustv ovise o njihovoj topljivosti u vodi. Budući d to ujedno određuje i njihov fiziološk funkcionln svojstv, uobičjeno se posebno rzmtrju netopljiv i topljiv prehrmben vlkn (Koprivnjk, 2014) Netopljiv prehrmben vlkn Netopljiv prehrmben vlkn (celuloz, hemiceluloz, neprobvljiv škrob) u debelom crijevu vežu n sebe veliku količinu vode, pri čemu bubre, povećvju volumen stolice te potiču crijevnu pokretljivost. Mnjim dijelom, ov prehrmben vlkn mogu podlijeći mikrobnoj rzgrdnji u crijevim. Specifičnu skupinu netopljivih prehrmbenih vlkn čini neprobvljiv ili rezistentn škrob koji je prisutn unutr stnične strukture hrne (kod kuhnog cjelovitog zrn žitric, u pojedinoj sirovoj i nedozreloj hrni poput sirovog krumpir i nedozrelih bnn), koji nstje uslijed retrogrdcije škrob u ohlđenoj termički 7

17 obrđenoj hrni ili se rdi o kemijski, fiziklno ili enzimski modificirnim škrobovim (Koprivnjk, 2014). Celuloz, ko glvn komponent stnične stjenke, grđen je od nerzgrntog lnc D- glukoze, poveznih β-1,4-glikozidnim vezm. Mehničk čvrstoć, otpornost n enzimsku rzgrdnju i kiselu hidrolizu te nisk topljivost u vodi posljedic su veznj vodik unutr mikrofibril. Hemiceluloz se od celuloze rzlikuje po tome što su lnci hemiceluloze mnji, rzgrnti i grđeni od rzličitih šećer, njčešće ksiloze, glktoze, mnoze, rbinoze i drugih. Lignin nije polishrid, već je grđen od fenilpropnskih jedinic uključujući i koniferilne, sinpilne i p-kumrilne lkohole. Lignini se rzlikuju po molekulskoj msi i sdržju metoksilne skupine, vrlo su inertni zhvljujući jkim intrmolekulrnim vezm ugljik-ugljik (Dhingr i sur., 2012) Topljiv prehrmben vlkn Topljiv prehrmben vlkn (pektini, inulin, miloz, β-glukni, gume, sluzi, lglni polishridi, ksntni, polidekstroz) otpnjem u vodi stvrju strukturu gel te su podložn mikrobnoj rzgrdnji u crijevim. Pritom nstju krtkolnčne msne kiseline (octen, propionsk i mslčn) koje služe ko izvor energije i potiču obnvljnje sluznice debelog crijev (Koprivnjk, 2014). Topljiv prehrmben vlkn uključuju vlkn koj su topljiv u vodi, li se tlože u 78 % etnolu (SDFP) poput β-glukn, gur gume i on topljiv u vodi i 78 % etnolu (SDFS) poput fruktooligoshrid, glktooligoshrid, polidekstroze, inulin i neprobvljivih mltodekstrin (McClery i sur., 2011). β-glukni i pojedine gume poput gur gume svrstvju se u skupinu vlkn topljivih u vodi, li netopljivih u 78 % etnolu. β-glukni su po svojem sstvu glukozni polimeri mnogo rzgrntiji u odnosu n celulozu budući d su glukozne jedinice vezne β-1-4- i β-1-3- glikozidnom vezom (Ktlinić, 2011). Pektinske tvri uz celulozu, hemicelulozu i lignin izgrđuju stničnu stijenku biljk. To su heteroshridi rzgrnte strukture sstvljene od glvnog i bočnih lnc. Glvni lnc čini D-glkturonsk kiselin povezn α (1-4) vezom, djelomično esterificirn metilnim lkoholom i mjestimično isprekidn molekulm L-rmnoze. Bočni oligoshridni lnci sstvljeni su većinom od D-glktoze i L-rbinoze. Pektin je dobro topljiv u vodi, im gelirjuć svojstv te stog može usporiti vrijeme prolsk hrne kroz probvni sustv. Gume 8

18 i sluzi nisu dijelovi stnične stjenke, već se formirju u specijlizirnim sekretornim stnicm biljk. Ovi polishridi su vrlo rzgrnti, vežu vodu i tvore gelove (Jenkins i sur., 1978). Zbog sposobnosti veznj vode i stvrnj strukture gel, upotrebljvju se i ko prehrmbeni ditivi, tj. sredstv z želirnje i zgušnjvnje. Koriste se prehrmben vlkn izdvojen iz prirodnih sirovin poput lgint i gr iz morskih lgi, gur gume iz sjemenki mhunrke Cymopsis tetrgonolob, lokust gume iz sjemenki rogč i drugih. Tkođer se ko sredstv z želirnje i zgušnjvnje koriste prehrmben vlkn dobiven od mikroorgnizm (ksntni) te prehrmben vlkn dobiven modifikcijom celuloze ko što su hidroksipropilmetilceluloz, krboksimetilceluloz i metilceluloz (Koprivnjk, 2014) Izvori prehrmbenih vlkn Prehrmben vlkn su prirodno prisutn u žitricm, povrću, voću, sjemenkm i oršstim plodovim. Udjel i sstv vlkn rzlikuje se ovisno o nmirnici. U Tblici 3 nveden je udjel prehrmbenih vlkn u pojedinim nmirnicm. Preporučeni dnevni unos vlkn z zdrvu osobu iznosi g (Howrth i sur., 2001). Tblic 3. Udjel prehrmbenih vlkn u nmirnicm (Dhingr i sur., 2012; Dodevsk i sur., 2015; Reyes-Cudillo i sur., 2008) Izvor Prehrmben vlkn (g 100 g -1 jestive porcije) Ukupn Netopljiv Topljiv Žitrice Ječm 17,3 Kukuruz 13,4 Zob 10,3 6,5 3,8 Riž 1,3 1,0 0,3 Pšenic 12,6 10,2 2,3 Povrće Krumpir 1,30 1,0 0,30 Cikl 7,8 5,4 2,4 Špint 2,6 2,1 0,5 Rep 2,0 1,5 0,5 Rjčic 1,2 0,8 0,4 9

19 Tblic 3. Udjel prehrmbenih vlkn u nmirnicm (Dhingr i sur., 2012; Dodevsk i sur., 2015; Reyes-Cudillo i sur., 2008) nstvk Prehrmben vlkn (g 100 g -1 jestive porcije) Izvor Ukupn Netopljiv Topljiv Mhunrke Soj 15,0 Gršk 3,5 3,2 0,3 Leć 11,4 10,3 1,1 Bijeli grh 17,7 13,4 4,3 Voće Jbuk 2,3 1,7 0,6 Jgod 2,2 1,1 1,1 Trešnj 2,1 1,0 1,1 Borovnic 2,9 2,1 0,8 Kupin 5,1 3,4 1,8 Mlin 5,5 2,6 2,9 Krušk 3,0 2,0 1,0 Breskv 1,9 1,0 0,9 Oršsti plodovi Orh 7,5 6,4 1,0 Lješnjk 9,5 8,1 1,4 Bdem 14,9 13,9 1,0 Indijski orh 5,2 4,2 1,0 Sjemenke Sezm 7,8 6,0 1,9 Ln 22,3 10,2 12,2 Chi 41,8 35,0 6,8 Prem Uredbi (EZ) br. 1924/2006, n proizvodim je dopušteno nvoditi prehrmbene tvrdnje o vlknim ukoliko proizvod sdrži određenu minimlnu propisnu količinu vlkn. Prehrmben tvrdnj d je nek hrn izvor prehrmbenih vlkn dopušten je smo ko tj proizvod sdrži njmnje 3 g prehrmbenih vlkn n 100 g proizvod. Prehrmben tvrdnj d je nek hrn visoko obogćen vlknim može biti istknut smo n proizvodim koji sdrže njmnje 6 g prehrmbenih vlkn n 100 g (Uredb (EZ) br. 1924/2006). Kod 10

20 oznčvnj hrnjive vrijednosti proizvod, nvođenje udjel prehrmbenih vlkn nije obvezno, li g je moguće nvesti nkon podtk o udjelu šećer (Koprivnjk, 2014; Uredb Komisije (EU) br. 432/2012) Utjecj prehrmbenih vlkn n zdrvlje Dvije glvne krkteristike vlkn koje rezultirju dokumentirnim pogodnostim z zdrvlje proizlze iz činjenice d on prolze netknut kroz probvni sustv sve do debelog crijev gdje se, ovisno o vrsti vlkn, u potpunosti ili djelomično fermentirju (Megzyme, 2013). Trdicionlno se smtrlo d su vlkn dobr jer djeluju ko sredstvo z čišćenje probvnog sustv mehničkim prolzom kroz njeg. Dns postoje znnstveni dokzi koji potvrđuju ove tvrdnje. Vlkn smnjuju vrijeme prolz hrne kroz probvni sustv i time smnjuju kontkt između kncerogenih spojev i stnic sluznice. Tkođer, vlkn mogu i vezti potencijlne luminlne kncerogene poput sekundrnih žučnih kiselin (Lttimer i Hub, 2010; Mcfrlne i Mcfrlne, 2012). U novije vrijeme znnstven istrživnj ukzuju n pozitivni utjecj prehrmbenih vlkn n crijevni mikrobiom. Konzumcijom određenih vlkn, uglvnom prebiotik, može se utjecti n porst broj dobrih bkterij u probvnom sustvu. Povećnjem broj zdrvih bkterij rste broj krtkolnčnih msnih kiselin poput butnske kiseline, propnske kiseline i octene kiseline koje se metbolizirju i korisne su z orgnizm. Zdnjih nekoliko godin proizvođči hrne sve više koriste znnstvene spoznje u ovom području kko bi rzvili proizvode bogte vlknim (Prnell i Reimer, 2012; Wong i sur., 2006) Prem Uredbi komisije (2012) z pojedin prehrmben vlkn postoji mogućnost isticnj zdrvstvenih tvrdnji n hrni koj ih sdrži u propisnom udjelu. Z vlkn pšeničnih posij, ječm, zobi i šećerne repe dopušteno je istknuti d doprinose povećnju volumen stolice, vlkn pšeničnih posij doprinose i ubrznju prolsk crijevnog sdržj, z vlkn rži dopušteno je istknuti d doprinose normlnoj funkciji crijev. Arbinoksiln iz pšeničnih klic, β-glukni iz zobi i ječm, hidroksipropilmetilceluloz, neprobvljiv škrob i pektini doprinose smnjenju porst glukoze u krvi poslije obrok dok kitozn, glukomnn konjc, hidroksipropilmetilceluloz i pektini doprinose održvnju normlne rzine kolesterol u krvi (Koprivnjk, 2014; Uredb komisije, 2012). 11

21 2.4. PROSO Proso je jedn od prvih kultivirnih žitric koj spd u porodicu trv Pnicoidee. Postoje brojne vrste pros, neke od njpozntijih su: biserno proso (Pennisetum glucum), koji čini 40 % svjetske proizvodnje pros, obično proso (Pnicum miliceum) i fričko proso (Eleusine corcn). Iko se trdicionlno konzumir u Aziji, u dnšnje vrijeme postje jedn od lterntivnih žitric u proizvodnji novih prehrmbenih proizvod u rzvijenim zemljm. Vodeće zemlje po proizvodnji pros su Indij, Nigerij, Niger, Kin i Rusij te čine 75 % ukupne svjetske proizvodnje. Proso je vrlo bitn žitric z zemlje u rzvoju zbog svoje otpornosti n sušu, štetočine i bolesti te krtkog vremen potrebnog z rst u usporedbi s drugim žitricm. Glvni prehrmbeni proizvodi dobiveni prerdom pros su oljušten zrn, bršno, posije i phuljice pros koji se mogu konzumirti direktno ili koristiti z proizvodnju kruh i tjestenine (Klinov, 2007; Srit i Singh, 2016; Issoufou i sur., 2013) Kemijski sstv pros Proso je jedinstven u svom kemijskom sstvu jer sdrži više klcij i prehrmbenih vlkn u odnosu n druge žitrice (Issoufou i sur., 2013). Sdrži % ugljikohidrt, 7 11 % protein, 1,5 5 % msti, 2 7 % vlkn te je bogt vitminim i minerlnim tvrim (Klinov, 2007). Usporedb udjel protein, vlkn, minerlnih tvri, željez i klcij u njpozntijim vrstm pros prikzn je u Tblici 4. Tblic 4. Usporedb kemijskog sstv oljuštenog zrn njpozntijih vrst pros (Srit i Singh, 2016) Vrst pros Proteini (g 100 g -1 ) Sirov vlkn Minerlne tvri Željezo (mg 100 g -1 ) Klcij (mg 100 g -1 ) (g 100 g -1 ) (g 100 g -1 ) biserno proso 10,6 1,3 2,3 16,9 38 obično proso 12,5 2,2 1,9 0,8 14 fričko proso 7,3 2,6 2,7 3,9 344 Proteini pros dobr su izvor esencijlnih minokiselin metionin i cistein. Budući d ne sdrži gluten, prepoznto je ko jedn od žitric z prehrnu osob koje boluju od celijkije. 12

22 Udjel vlkn u oljuštenom zrnu pros iznosi 0,8 1,2 %, u neoljuštenom zrnu oko 9,6 % (Klinov, 2007). Topljiv vlkn iznose oko 36 % ukupnih vlkn. Stničn stjenk pros izgrđen je od lignin, ksiloglukn, rbinoksiln, uronskih kiselin, rbinozil, glktozilnih osttk, rbinoglktn i β-d glukn, što je slično drugim vrstm trv (Klinov, 2007). Osim vlkn, proso je odličn izvor vitmin B, mgnezij i ntioksidns. Tkođer sdrži i druge minerlne tvri poput mngn, fosfor, željez i klcij (Klinov, 2007; Srit i Singh, 2016). Po energetskoj vrijednosti (341 kcl 100 g -1 ) može se usporediti s pšenicom, kukuruzom ili rižom (348, 358, 362 kcl 100 g -1 ) (Klinov, 2007) BUČINA POGAČA Buč Buč je biljk iz porodice Curcubitcee čiji se plod koristi z prehrnu ljudi i životinj. Postoji nekoliko vrst buč: Cucurbit pepo, Cucurbit moscht, Cucurbit mxim i Cucurbit mixt. Plodovi imju čvrstu koru, mekno, sočno meso, vrirju u veličini, boji i obliku. U sredini mes buče nlzi se šupljin ispunjen sjemenkm. Bučine sjemenke koriste se z proizvodnju bučinog ulj ili ko snck proizvod i dobr su izvor ulj i protein (Alfwz, 2004; Asgry i sur., 2011) Bučin pogč Bučin pogč se dobiv ko nusproizvod pri proizvodnji bučinog ulj prešnjem. Pogč bučinih sjemenki može se upotrebljvti n rzne nčine, ko stočn hrn, li i ko hrn z ljudsku prehrnu. Tko se primjerice mljeven pogč bučinih sjemenki miješ s pšeničnim bršnom pri proizvodnji posebnih vrst kruh s većim udjelom protein podrijetlom iz bučine pogče (Pirmn i sur., 2007; Moslvc i sur., 2014). Kruh tkvog sstv obogćen je bioktivnim komponentm koje imju pozitivn utjecj n ljudsko zdrvlje poput prehrmbenih vlkn i nezsićenih msnih kiselin (Trek-Tilistyk i sur., 2017). 13

23 Sstv bučine pogče Rzlike u mljevenju, temperturi, vremenu prženj i prešnj sjemenki uvelike utječu n sstv pogče. Prem istrživnju Pirmn i sur. (2007), uzork bučine pogče sdržvo je 52,02 g sirovih protein, 28,34 g sirove msti, 4,50 g sirovih vlkn i 6,95 g pepel n 100 g suhe tvri. Tkođer, određene su visoke vrijednosti udjel fosfor (1,52 g n 100 g suhe tvri) i klij (1,29 g n 100 g suhe tvri) (Pirmn i sur., 2007). Rzlik u kemijskom sstvu cijelih sjemenki i jezgri sjemenki buče prikzn je u Tblici 5 (Alfwz, 2004). Tblic 5. Kemijski sstv bučinih sjemenki (Alfwz, 2004) Udjel (%) Cijele bučine sjemenke Jezgr bučine sjemenke Proteini 39,25 ± 0,66 39,22 ± 2,46 Msti 27,83 ± 0,91 43,69 ± 3,92 Pepeo 4,59 ± 0,16 5,14 ± 1,23 Vlkn 16,84 ± 0,81 2,13 ± 0,57 Jednostvni ugljikohidrti 11,48 ± 2,53 9,82 ± 2,70 Trek-Tilistyk i sur. (2017) ispitivli su sstv rzličitih pogč sjemenki uljric. Određen je sljedeći sstv pogče bučinih sjemenki: 7,2 ± 0,2 % vlge, 50,4 ± 0,5 % protein, 8,2 ± 0,3 % msti, 7,2 ± 0,3 % pepel, 27,0 ± 1,3 % ukupnih ugljikohidrt, 23,2 ± 0,5 % ukupnih vlkn i 16,2 ± 0,2 % topljivih vlkn. Određen energetsk vrijednost iznosi 383 kcl 100 g -1 (Trek-Tilistyk i sur., 2017). 14

24 3. EKSPERIMENTALNI DIO 3.1. UZORCI U eksperimentlnom dijelu ovog diplomskog rd ispitivn je utjecj kriomljevenj n udjel netopljivih vlkn, vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu i topljivih vlkn u uzorcim frkcije posij pros i bučine pogče. Z provedbu ovog istrživnj korišten je frkcij posij običnog pros sorte Sonček (Pnicum miliceum) uzgojenog godine, uzetog iz industrijske prerde tvrtke Mlinopek (Mursk Sobot, Slovenij) s česticm mnjim od 500 μm. Odbrn frkcij je prehrmbeno bogtij od ukupnih posij jer sdrži povišeni udjel msti i protein (rezultti nisu prikzni u ovom rdu) te se može pretpostviti d sdrži leuronski sloj zrn (Hbuš, 2018). Bučin pogč dobiven je od proizvođč bučinog ulj, tvrtke Grbić d.o.o., Požeg, usitnjen je n lbortorijskom mlinu, prosijn i z nlizu su korištene čestice mnje od 1 mm (Dorić i Vidković, 2018). Mljevenje posij pros i bučine pogče provedeno u okviru istrživnj Hbuš (2018) i Dorić i Vidković (2018). Kriomljevenje je provedeno n kriomlinu Retsch Cryomill (Njemčk). Uzorci posij pros mljeveni su u trjnju od 2, 4, 8 i 12 minut s i bez primjene hlđenj tekućim dušikom (Tblic 6). Uzorci bučine pogče mljeveni su n kriomlinu u trjnju od 4, 8 i 12 minut bez primjene hlđenj, s primjenom hlđenj te s primjenom hlđenj i intermedijrnog hlđenj (svke dvije minute mljevenj stnk z dvije minute intermedijrnog hlđenj) (Tblic 7). Prije postupk određivnj vlkn, uzorci bučine pogče su odmšćeni postupkom ekstrkcije s heksnom i cetonom kko je opisno u rdu Dorić i Vidković (2018). Udjel vlkn određen je i u kontrolnim uzorcim posij pros i bučine pogče, pri čemu su bučin pogč i oljušteno zrno pros usitnjeni pomoću lbortorijskog mlin. 15

25 Tblic 6. Uvjeti mljevenj uzork posij pros n kriomlinu Uzork Trjnje mljevenj (min) Hlđenje tijekom mljevenj 0 2H 2 d 4H 4 d 8H 8 d 12H 12 d 2BH 2 ne 4BH 4 ne 8BH 8 ne 12BH 12 ne OZ Oljušteno zrno smljeveno n lbortorijskom mlinu i prosijno kroz sito s veličinom por 450 µm Tblic 7. Uvjeti mljevenj uzork bučine pogče n kriomlinu Uzork Trjnje mljevenj (min) Hlđenje tijekom mljevenj 0 4BH 4 bez hlđenj 8BH 8 bez hlđenj 12BH 12 bez hlđenj 4H 4 s hlđenjem 8H 8 s hlđenjem 12H 12 s hlđenjem 4HI 4 s hlđenjem i intermedijrnim hlđenjem 8HI 8 s hlđenjem i intermedijrnim hlđenjem 12HI 12 s hlđenjem i intermedijrnim hlđenjem Tkođer, ispitivn je i utjecj ultrzvuk visokog intenzitet n udjel netopljivih vlkn, vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu i topljivih vlkn u uzorcim posij pros (veličin čestic < 500 µm). Tretmn ultrzvukom proveden je u okviru istrživnj Gudelj (2018). Uzorci su tretirni ultrzvučnim procesorom Hielscher UP400S snge 400 W, frekvencije titrnj 24 khz, s sondom promjer 22 mm pri 100 %, 80 % i 60 % mplitude ultrzvučnog vl, u trjnju od 5, 12,5 i 20 minut. Tretmn ultrzvukom visokog intenzitet 16

26 proveden je u stklenoj čši volumen 600 ml s 45 g uzork posij pros i 300 ml vode. Kontrolni uzork je podvrgnut miješnju n mgnetskoj miješlici kroz 20 minut bez tretmn ultrzvukom. Nkon tretmn uzorci su liofilizirni i čuvni pri -18 C do nlize (Gudelj, 2018). Pln pokus izrđen je prem centrlnom kompozitnom dizjnu, mplitud i vrijeme tretmn pojedinog uzork posij pros prikzni su u Tblici 8. Tblic 8. Uvjeti tretmn uzork posij pros ultrzvukom visokog intenzitet Uzork Amplitud (%) Vrijeme (min) K 20' 20 60A 5' A 12,5' 60 12,5 60A 20' A 5' A 12,5' 80 12,5 80A 12,5' 80 12,5 80A 12,5' 80 12,5 80A 12,5' 80 12,5 80A 12,5' 80 12,5 80A 20' A 5' A 12,5' ,5 100A 20' METODA ODREĐIVANJA VLAKANA Udjel vlkn u nlizirnim uzorcim određen je pomoću enzimsko-grvimetrijske metode i tekućinske kromtogrfije visoke djelotvornosti s detektorom indeks refrkcije (engl. High Performnce Liquid Chromtogrphy with Refrctive Index Detector HPLC-RI). Z određivnje vlkn netopljivih u vodi (IDF), topljivih u vodi i netopljivih u 78 % etnolu (SDFP) te topljivih u vodi i u 78 % etnolu (SDFS) korišten je AOAC metod

27 Princip AOAC metode Uzorci se inkubirju s α-milzom porijeklom iz gušterče i miloglukozidzom. Uslijed djelovnj nvedenih enzim, nerezistentni škrob se hidrolizir do D-glukoze, mltoze i djelomično rezistentnih mltodekstrin u trgovim. Rekcij se zustvlj prilgođvnjem ph n 8,2 i krtkim zgrijvnjem. Proteini u uzorku se ztim rzgrđuju i denturirju protezom. Netopljiv prehrmben vlkn se izdvjju filtrcijom, ispiru, suše i vžu. Prehrmben vlkn topljiv u vodi i netopljiv u 78 % etnolu zostl u filtrtu se potom tlože s 78 % etnolom, tlog se potom filtrir, suši i vže. Ms obju tlog korigir se s obzirom n udjel protein i pepel. Preostli filtrt se koncentrir, potom deionizir, otopi u vodi te se udjel vlkn topljivih u vodi i 78 % etnolu odredi HPLC-RI metodom (Megzyme, 2013b) Kemiklije celit, nlyticl grde, Megzyme otopin sredstv z prnje lončić, 2 %, Micro-90 ceton, pro nlysi, Grm-mol etnol, 95 %, Kefo etnol, 78 % (v/v) (Priprem: u odmjernu tikvicu od 1 L dodti 180 ml destilirne vode i ndopuniti 95 % etnolom do oznke.) smol Amberlite 200CN, ROHM AND HAAS FRANCE S.A.S., Dow (ktivcij ntpnjem 30 minut u dvostruko većem volumenu 7 % HCl, potom ispirnje) smol Amberlite FPA53, ROHM AND HAAS FRANCE S.A.S., Dow klcijev klorid dihidrt, Sigm-Aldrich mletn kiselin, 99 %, RegentPlus, Sigm-Aldrich ntrij-mletni pufer, 50 mm, ph = 6,0 s klcij klorid dihidrtom (Priprem: u 800 ml vode u odmjernoj tikvici od 1 L otopiti 5,8 g mleinske kiseline te potom podesiti ph n 6,0 s 4 M NOH. Dodti 0,3 g klcijevog klorid dihidrt i ndopuniti tikvicu do oznke.) octen kiselin, 2 M (Priprem: iz ledene octene kiseline, 99,5 %, Mcron) klcij dintrij EDTA hidrt, 97,0 %, Fluk 18

28 2-mino-2-(hidroksimetil)-1,3-propnediol, primrni stndrd i pufer, 99,9 %, TI503, Sigm-Aldrich tris pufer, 0,75 M (Priprem: otopiti 90,8 g 2-mino-2-(hidroksimetil)-1,3- propnediol u 800 ml deionizirne vode (ph 10,5) u odmjernu tikvicu od 1 L i ndopuniti vodom do oznke) D-sorbitol, Megzyme kit (Priprem: voden otopin koncentrcije 100,4 mg ml -1 ) miloglukozidz 3300 jedinic ml -1, otopljen u 50 % (v/v) glicerolu, Megzyme kit pnkresn α-milz 50 jedinic ml -1, Megzyme kit protez 50 mg ml -1 ; 350 jedinic tirozin ml -1, otopljen u 50 % (v/v) glicerolu, Megzyme kit Uređji i ostl oprem nlitičk vg, ALS220-4N, Kern voden kupelj s tresilicom, SBS40, Sturt štoperic, Oregon ph metr 3510, Jenwy mgnetsk miješlic RT 5, IKA-WERKE rotvpor, Hiedolph termometr, Qurtz sušionik ST-01/02, Instrumentri mufoln peć, KR170,W. C. HERAEUS HANAU njlonski membrnski filter, 0,45 µm HNWP, Kefo njlonski filter z špricu, 0,45 µm, Lbex Ltd., FilterBio HPLC uređj, Shimdzu o pump LC-10AD, Shimdzu o odzrčivč DGU-14A, Shimdzu o pećnic CTO-10AS, Shimdzu o detektor indeks lom RID-10A, Shimdzu o progrm LCsolution Version 1.22 SP1, Shimdzu stklene Durn boce s čepom, 250 ml, 500 ml i 1 L lončići z filtrciju, Durn 2 odsisn boc 19

29 stkleni dpter z lončiće z filtrciju gumeni prsten eksiktor grduirne pipete (20 ml) utomtsk propipet menzur (50 ml, 100 ml, 1 L) okrugl tikvic s rvnim dnom (250 ml, 500 ml) šptul plstične Eppendorf epruvete (1,5 ml) plstične Flcon epruvete (15 ml, 50 ml) set mgnet kolon z deionizciju stklen čš (100 ml) vt Priprem lončić z filtrciju Lončići su spljivni 7 sti u mufolnoj peći n 525 C. Ohlđeni lončići su nmočeni u 2 % otopinu z prnje i ostvljeni 1 st. Nkon nmknj, lončići su isprni njprije vodom, potom s oko 10 ml ceton. U suhe lončiće odvgno je oko 1 g celit. Lončići su spljivni 7 sti u mufolnoj peći n 525 C, ztim ohlđeni u eksiktoru i izvgni Priprem uzork Prije određivnje vlkn, uzorci bučine pogče odmšćeni su postupkom ekstrkcije s heksnom i cetonom kko je opisno u rdu Dorić i Vidković (2018). Uzorke posij pros nije bilo potrebno odmstiti jer sdrže mnje od 10 % msti (Hbuš, 2018). Izvgno je 1,0000 ± 0,0050 g mljevenog uzork (2 prlelne probe z svki uzork) u Durn boce od 250 ml s čepom te je potom uzork nvlžen s 1 ml 95 % etnol. Pripremljen je otopin pnkresne α-milze i miloglukozidze u N-mletnom puferu koncentrcije pnkresne α-milze 50 jedinic ml -1 i koncentrcije miloglukozidze 3,4 jedinice ml -1. Pripremljen otopin homogenizirn je 5 minut n mgnetskoj miješlici nkon čeg je 20

30 uzorku dodno 40 ml iste. Tko pripremljeni uzork homogenizirn je n mgnetskoj miješlici 5 minut prije inkubcije. Uzork je inkubirn 16 h u vodenoj kupelji, pri 37 C, uz orbitlno miješnje brzinom 120 okr. min -1. Nkon 16 sti inkubcije rekcij je zustvljen dodtkom 3,0 ml 0,75 M TRIS pufer. Uzork je potom homogenizirn n mgnetskoj miješlici 2 minute i stvljen u drugu vodenu kupelj temperirnu n C, 20 minut, pri čemu je vrijeme mjereno nkon što je uzork postigo temperturu od 90 C. Nkon 20 minut, uzork je ohlđen n temperturu od 60 C, ztim mu je dodno 100 µl proteze. Uzork je homogenizirn 2 minute n mgnetskoj miješlici te potom stvljen n inkubciju u vodenu kupelj 30 minut, pri 60 C, uz orbitlno miješnje brzinom 120 okr. min -1. Po isteku vremen, uzork je izvđen iz kupelji te mu je odmh dodno 4 ml 2 M octene kiseline i 1 ml otopine internog stndrd sorbitol. Uzork je homogenizirn 1 minutu n mgnetskoj miješlici te je bio spremn z filtrciju Određivnje netopljivih vlkn (IDF) N prethodno spljeni i izvgni lončići s celitom dodno je 10 ml 78 % etnol, celit je promiješn šptulom kko bi se rvnomjerno rsporedio n dnu lončić z filtrciju te je ztim dodni etnol uklonjen filtrcijom pod vkuumom u odsisnu bocu. Uzork je potom kvntittivno prenesen i filtrirn preko istog lončić z filtrciju. Zosttk uzork n stjenkm boce z inkubciju prenesen je n lončić ispirnjem s 35 ml vode zgrijne n 60 C, u obrocim od 5 ml. Po zvršetku filtrcije, filtrt je iz odsisne boce prenesen u menzuru od 100 ml, ndopunjen destilirnom vodom do 85 ml i čuvn z određivnje SDFP. Lončić s tlogom isprn je dv put s 15 ml 78 % etnol, dv put s 15 ml 95 % etnol i dv put s 15 ml ceton. Isprni lončić s IDF pokriven luminijskom folijom stvljen je n sušenje 7 sti pri 105 C. Nkon sušenj, lončić je ohlđen u eksiktoru i izvgn. Ms IDF izrčunt je prem jedndžbi [1]: m 1 = m 3 m 2 [1] m 1 ms IDF u uzorku (g) m 2 ms lončić s celitom (g) m 3 ms lončić s celitom i IDF u uzorku (g) 21

31 U jednom preostlom tlogu određen je udjel protein, u drugom udjel pepel (prem metodm u poglvljim 3.3. i 3.4.) te je ms IDF korigirn s obzirom n udjel protein i pepel prem jedndžbi [2]: [2] m 1 ms IDF u uzorku (g) m 2 ms IDF korigirn z udjel protein i pepel, u 1 g uzork (g) m 3 ms uzork uzetog u nlizu (g) sp slijep prob (g) Udjel suhe tvri u uzorku određen je prem metodi u poglvlju 3.5. i rezultt je izržen ko ms IDF u 100 g suhe tvri (g) prem jedndžbi [3]: [3] m (IDF) ms IDF u 100 g suhe tvri uzork (g) m 1 ms IDF korigirn z udjel protein i pepel, u 1 g uzork (g) Određivnje vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu (SDFP) Filtrt i 95 % etnol ugrijni su n 60 C, pomiješni, ručno dobro protreseni i stvljeni n tloženje njmnje 1 st pri sobnoj temperturi. N prethodno spljeni i izvgni lončić s celitom dodno je 10 ml 78 % etnol, celit je promiješn šptulom te je ztim dodni etnol uklonjen filtrcijom pod vkuumom u odsisnu bocu. Uzork je potom kvntittivno prenesen i filtrirn preko istog lončić z filtrciju. Stjenke boce su rdi kvntittivnog prenošenj isprne u lončić s 78 % etnolom. Dobiveni filtrt je prenesen u menzuru, potom pol volumen filtrt u okruglu tikvicu s rvnim dnom z uprvnje. Filtrt je upren n rotvporu pod vkuumom pri 60 C do suhog. Upreni uzork otopljen je u 5 ml deionizirne vode uz rotciju 2 minute n rotvporu i ko tkv je čuvn zmrznut do određivnj topljivih vlkn. Lončić s tlogom isprn je dv put s 15 ml 78 % etnol, dv put s 15 ml 95 % etnol i dv put s 15 ml ceton. Isprni lončić s SDFP pokriven luminijskom folijom stvljen je n sušenje 7 sti pri 105 C. Nkon sušenj, lončić je ohlđen u eksiktoru i izvgn. 22

32 Ms SDFP izrčunt je prem jedndžbi [4]: [4] m 1 ms SDFP iz uzork (g) m 2 ms lončić s celitom (g) m 3 ms lončić s celitom i SDFP (g) U jednom preostlom tlogu određen je udjel protein, u drugom udjel pepel (prem metodm u poglvljim 3.3. i 3.4.) te je SDFP je korigirn s obzirom n udjel protein i pepel prem jedndžbi [5]: [5] m 1 ms SDFP iz uzork (g) m 2 ms SDFP korigirn z udjel protein i pepel, u 1 g uzork (g) m 3 ms uzork uzetog u nlizu (g) sp slijep prob (g) Udjel suhe tvri u uzorku određen je prem metodi u poglvlju 3.5. i rezultt je izržen ko ms SDFP u 100 g suhe tvri prem jedndžbi [6]: [6] m (SDFP) ms SDFP u 100 g suhe tvri uzork (g) m 1 ms SDFP korigirn z udjel protein i pepel, u 1 g uzork (g) Određivnje vlkn topljivih u vodi i 78 % etnolu (SDFS) Deionizcij uzork Njprije je odvgno 4 g smole Amberlite 200CN i 4 g smole Amberlite FPA53 u čšu te je dodno mlo vode, sdržj je dobro homogenizirn i preliven u kolonu z deionizciju s otvorenim ventilom. N vrh smole u koloni stvljeno je mlo vte te je kolon potom isprn 23

33 s 20 ml vode. N kolonu je nneseno 2 ml uzork te potom 2 ml vode. Protok elucije iznosio je 1 ml min -1 (1 kpi u 3 sekunde). Nkon elucije uzork, n kolonu je dodno 20 ml vode i eluirno istom brzinom u plstičnu epruvetu od 50 ml. Elut je prebčen u tikvicu z uprvnje od 250 ml i upren n rotvporu uz vkuum pri 60 C do suhog. Upreni uzork otopljen je u 2 ml vode, uz rotciju 2 minute n rotvporu. Ovko pripremljeni uzork filtrirn je preko 0,45 µm filter z špricu, prebčen u plstičnu Eppendorf epruvetu od 1,5 ml i čuvn zmrznut do određivnj HPLC metodom Postupk određivnj SDFS SDFS određen su n HPLC uređju s detektorom indeks lom (RI) pri sljedećim uvjetim nlize: Kolon: METACARB 67C, Agilent Technologies Mobiln fz: voden otopin klcij dintrij EDTA hidrt, 50 mg L -1, profiltirirn i odzrčen u ultrzvučnoj kupelji Protok mobilne fze: 0,5 ml min -1 Tempertur kolone: 80 C Tempertur ćelije RI detektor: 40 C Ms SDFS (mg 100 g -1 ) izrčunt je prem jedndžbi [7]: [7] m (SDFS) ms topljivih vlkn (mg 100 g -1 ) Rf fktor odgovor m (IS) ms internog stndrd u 1 ml otopine (mg) PA_SDFS površin pik topljivih vlkn PA_IS površin pik internog stndrd m ms uzork čiji filtrt je nlizirn (g) 24

34 Priprem slijepe probe Kko bismo uklonili greške u nlizi izzvne utjecjem regens i postupk, nprvljen je slijep prob u koju nije dodn uzork, li je dljnj priprem bil pri istim uvjetim, identičn ostlim uzorcim, prem protokolu metode. Ms slijepe probe (mg) izrčunt je prem jedndžbi [8]: [8] m s.p. 1 ms osttk z prvu prlelu slijepe probe (mg) m s.p. 2 ms osttk z drugu prlelu slijepe probe (mg) m (protein) ms protein određen iz rezidu slijepe probe (mg) m (pepel) ms pepel određen iz rezidu slijepe probe (mg) (Megzyme, 2013b; AOAC ) 3.3. METODA ODREĐIVANJA PROTEINA Kemiklije born kiselin, 40 g L -1 (priprem: iz borne kiseline, %, Grm-mol uz dodtk 12,5 mg L -1 indiktor bromkrezol-zeleno i 8,75 mg L -1 indiktor metilno crvenilo) sumporn kiselin, 96 %, CARLO ERBA Regents S.A.S. klorovodičn kiselin, 0,01 mol L -1 (priprem: iz klorovodične kiseline, 37 %, CARLO ERBA Regents S.A.S.) ntrijev hidroksid, 0,01 mol L -1 (priprem: iz ntrijevog hidroksid, 98 %, Smgo d.o.o.) kjeldhl tblete bez Se i Hg, 5 g/tblet, MerckKGA Uređji i ostl oprem blok z spljivnje 1007, Tector Kjeltec TM 8100, Tector TM Line 25

35 Kjeltec kivete Erlenmeyerove tikvice (250 ml) Princip određivnj Udjel protein određen je metodom po Kjeldhl-u. Orgnske tvri u uzorku se rzore zgrijvnjem s sumpornom kiselinom i pri tome dolzi do oslobđnj proteinskog i neproteinskog dušik koji zostje u obliku monijevog sulft. H 2 SO 4 + Kjeldhl ktliztor orgnski dušik (NH 4 ) 2 SO 4 oksidcij + visok tempertur U Kjeltec uređju provodi se lklizcij u suvišku i potom destilcij u bornu kiselinu u suvišku. (NH 4 ) 2 SO NOH 2NH 3 + N 2 SO 4 + 2H 2 O 3NH 3 + H 3 BO 3 (NH 4 ) 3 BO 3 Potom se provodi titrcij monijevog bort klorovodičnom kiselinom. (NH 4 ) 3 BO 3 + 3HCl 3(NH 4 )Cl + H 3 BO Postupk određivnj Uzork i celit iz lončić su preneseni u Kjeldhlovu kivetu. U svku kivetu je dodn jedn Kjeldhl tblet i 12 ml 96 % sumporne kiseline. Uzork je spljivn u bloku z spljivnje do postiznj plvo-zelene boje bez vidljivih crnih osttk te su potom kivete s uzorkom ohlđene prije dljnje nlize. U Erlenmeyerovu tikvicu dodno je 25 ml 4 % borne kiseline s indiktorim. Tikvic s bornom kiselinom i kivet s spljenim uzorkom postvljene su u Kjeltec uređj, n kojem je destilcij proveden pri sljedećim uvjetim: Volumen vode: 80 ml Volumen lužine: 50 ml Vrijeme destilcije: 4 minute. 26

36 Dobiveni destilt je potom titrirn klorovodičnom kiselinom koncentrcije 0,01 mol L -1 do promjene boje iz zelene u ružičstu. Udjel dušik izrčunt je prem jedndžbi [9], udjel protein u uzorku prem jedndžbi [10]: š [9] š [10] T volumen titrnt uzork V (HCl) (ml) B volumen titrnt slijepe probe V (HCl) (ml) N molritet klorovodične kiseline m ms uzork (mg) F fktor pretvorbe z proteine 6,25 (ICC 105/2; Megzyme, 2013b) 3.4. METODA ODREĐIVANJA PEPELA Uređji i ostl oprem mufoln peć, KR170,W. C. HERAEUS HANAU eksiktor nlitičk vg, ALS220-4N, Kern Postupk određivnj Lončić s uzorkom spljivn je u mufolnoj peći 7 sti pri 525 C, potom je ohlđen u eksiktoru i izvgn. Udjel pepel u uzorku izrčunt je prem jedndžbi [11]: [11] m 1 ms vlkn bez korekcije (g) m 2 ms lončić s celitom (g) m 3 ms lončić s celitom i pepelom (g) (Megzyme, 2013b) 27

37 3.5. METODA ODREĐIVANJA VODE/SUHE TVARI Uređji i oprem luminijsk posudic sušionik ST-01/02, Instrumentri eksiktor nlitičk vg, ALS220-4N, Kern Postupk određivnj U prethodno osušenu, ohlđenu i izvgnu luminijsku posudicu izvgno je 3,000 ± 0,0001 g uzork. Uzork je sušen u sušioniku pri 130 C, do postiznj konstntne mse. Prije vgnj uzork je ohlđen u eksiktoru. Iz rzlike u msi uzork izrčunt je udjel vode prem jedndžbi [12] i udjel suhe tvri prem jedndžbi [13]: [12] [13] m 1 ms przne posudice (g) m 2 ms posudice s uzorkom prije sušenj (g) m 3 ms posudice s uzorkom nkon sušenj (g) (NN 28/2011) 3.6. OBRADA REZULTATA Rezultti su obrđeni i grfički prikzni pomoću progrm Excel Sttističk nliz nprvljen je u progrmu Sttistic 10, Stt Soft Inc. Primijenjeni su testovi nliz vrijnce (ANOVA) i Tukey test, uz rzinu sttističke znčjnosti α = 0,05. 28

38 Udjel IDF (%) n suhu tvr uzork 4. REZULTATI I RASPRAVA U ovom diplomskom rdu ispitivn je utjecj kriomljevenj n udjel netopljivih vlkn (IDF), vlkn topljivih u vodi, netopljivih u 78 % etnolu (SDFP) i vlkn topljivih u vodi i 78 % etnolu (SDFS) u uzorcim posij pros i bučine pogče, ko i utjecj tretmn ultrzvukom visokog intenzitet n udjel nvedenih vlkn u uzorcim posij pros. Tkođer, u rdu je ispitn i sstv vlkn oljuštenog zrn pros, ko uobičjenog oblik konzumcije pros, s ciljem usporedbe s odbrnom frkcijom posij pros. Z određivnje IDF, SDFP i SDFS korišten je AOAC metod Rezultti određene srednje vrijednosti i stndrdne devijcije udjel vlkn n suhu tvr uzork su prikzni grfički UTJECAJ KRIOMLJEVENJA NA UDJEL VLAKANA U UZORCIMA POSIJA PROSA N sljedećim slikm prikzni su dobiveni rezultti udjel nvedenih skupin vlkn u uzorcim posij pros tretirnih kriomljevenjem. Udjel IDF u uzorcim posij pros tretirnih kriomljevenjem prikzn je n Slici OZ 0 2H 4H 8H 12H 2BH 4BH 8BH 12BH Slik 1. Udjel IDF u uzorcim posij pros mljevenim n kriomlinu (istim slovom oznčene su vrijednosti među kojim nem sttistički znčjne rzlike (p > 0,05)) 29